FastKing One Step RT-PCR Kit Featured Image

FastKing Siji Langkah Kit RT-PCR

Reagen siji-langkah RT-PCR luwih efisien lan sensitif.

FastKing One Step RT-PCR Kit nggunakake metode siji langkah supaya RT lan PCR bisa ditindakake ing sistem reaksi sing padha. Ora ana reagen sing kudu ditambahake lan tutup tabung ora prelu dibukak ing proses reaksi, saengga bisa nyegah kontaminasi silang ing antarane sampel lan nambah sensitivitas deteksi. 25 × RT-PCR Enzim Campur ing kit kasebut minangka wujud campuran prosedhur saka TIANGEN novel reverse transcriptase (King RTase), polimerase Taq DNA sing diwiwiti kanthi modifikasi antibodi lan Inhibitor RNase. Nduwe afinitas RNA sing kuat lan stabilitas termal, kemampuan extension template template RNA sekunder sing kompleks, lan efisiensi lan kekhususan amplifikasi sing luwih dhuwur kanggo cDNA sawise transkripsi balik. Kajaba iku, 2 × FastKing One Langkah RT-PCR MasterMix ing produk iki minangka jinis sistem reaksi anyar sing dioptimalake khusus kanggo rong enzim kunci ing ndhuwur, sing ngemot komponen ionik, dNTP, stabilisator PCR lan alat tambahan. Iki njamin manawa polimerase King RTase lan Taq duwe kinerja sing paling apik sajrone proses reaksi siji-langkah.

Kucing Ora	Ukuran Kemasan
4992294	50 ×l × 50 rxn

Kirim email menyang kita

Detail Produk

Tuladha Eksperimen

FAQ

Tag Produk

Fitur

■ Kemurnian: Reaksi transkripsi balik lan PCR rampung ing sawijining langkah kanggo ngindhari kontaminasi silang.
■ Efisiensi Tinggi: Transkripase terbalik King Unik kanthi efisiensi RT luwih saka 95%.
■ Sensitif: Cithakan kurang saka 1 ng bisa diidentifikasi kanthi akurat, utamane kanggo template sing kurang akeh.
■ Kekhususan: Polimerase Taq sing diowahi kanthi antibodi luwih bisa ningkatake efisiensi lan kekhususan amplifikasi.

Aplikasi

Cocog kanggo ndeteksi level ekspresi gen ing sel lan jaringan, kloning cDNA gen tartamtu lan ndeteksi virus RNA. Utamane cocog kanggo ndeteksi kualitatif template sing kurang akeh.

Kabeh produk bisa disesuaikan kanggo ODM / OEM. Kanggo rincian,monggo klik Layanan Khusus (ODM / OEM)

Sedurunge: FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix

Sabanjure: Kit PCR Multi

RNA total virus penyakit sikil lan tutuk lan sampel jaringan manungsa diekstraksi. Transkrip terbalik lan PCR fragmen target kanthi dawa sing beda nggunakake TIANGEN FastKing One Step RT-PCR Kit (1), produk sing relevan saka Supplier A (2) lan Supplier B (3) lan mirsani produk PCR sawise elektroforesis. Asil nuduhake manawa band FastKing One Step RT-PCR Kit cetha lan padhang, tanpa tailing lan ora ana band sing ora spesifik, lan template 1 ng bisa dideteksi kanthi apik. Asil eksperimen TIANGEN luwih apik tinimbang produk sing relevan.

P: Prodhuk RT-PCR sithik utawa ora

A-1 RNA diremehake

—— Purifikasi RNA berkualitas tinggi tanpa kontaminasi. Bahan sing diekstrak RNA kudu seger bisa nyegah degradasi RNA. Analisis integritas RNA ing gel denatured sadurunge reaksi RT. Sawise ekstraksi RNA, kudu disimpen ing formamida 100%. Yen penghambat RNase digunakake, suhu dadi panas <45 ° C, lan pH kurang saka 8,0, yen hambatan bakal ngeculake kabeh RNase. Kajaba iku, penghambat RNase kudu ditambahake ing solusi sing ngemot ≥ 0,8 mM DTT.

A-2 RNA ngemot penghambat reaksi transkripsi balik

——Rencat transponse kalebu SDS, EDTA, glisolol, natrium pirofosfat, spermidine, formamida, uyah guanidine, lan liya-liyane Campur kontrol RNA karo conto, lan bandhingake asil karo reaksi RNA kontrol kanggo mriksa manawa ana penghambat. Cuci RNA presipitasi kanthi etanol 70% (v / v) kanggo mbusak inhibitor.

A-3 Anil panyebaran primer sing ora cukup digunakake kanggo nyintesis untai pertama cDNA

—— Temtokake manawa suhu anil cocog kanggo primer sing digunakake ing eksperimen kasebut. Kanggo hexamers acak, dianjurake supaya suhu tetep 25 ° C nganti 10 menit sadurunge tekan suhu reaksi. Kanggo primer khusus gen (GSP), coba GSP liyane, utawa ganti menyang oligo (dT) utawa hexamer acak.

A-4 Cilik wiwit RNA

—— Nambah jumlah RNA. Kanggo conto RNA kurang saka 50 ng, 0,1 μg nganti 0,5 μg asetil BSA bisa digunakake ing sintesis cDNA untai pertama

A-5 Urutan target ora ditulis ing jaringan sing dianalisis.

—— Coba jaringan liya.

Reaksi PCR A-6 gagal

—— Kanggo RT-PCR rong langkah, template cDNA ing langkah PCR ora bisa ngluwihi 1/5 volume reaksi.

P: Band sing ora spesifik katon

A-1 Anilem primer lan template sing ora spesifik

—— 3er mburi primer ora ngemot 2-3 dG utawa dC. Gunakake sepisanan khusus gen ing sintesis untai pertama tinimbang primer acak utawa oligo (dT). Gunakake suhu anil sing luwih dhuwur ing sawetara siklus pisanan, lan banjur suhu annealing ngisor. Gunakake polimerase DNA Taq sing paling anyar kanggo PCR kanggo nambah kekhususan reaksi.

A-2 Desain primer khusus gen sing kurang apik

—— Tindakake prinsip sing padha kanggo desain primer amplifikasi.

A-3 RNA sing terkontaminasi karo DNA genom

—— Nambani RNA nganggo PCN-grade PCR I. Nggawe reaksi kontrol tanpa transkripsi balik kanggo ndeteksi kontaminasi DNA.

A-4 Mbentuk primer dimer

——Desain primer tanpa urutan komplementer ing pungkasan 3 '.

A-5 Gedhe banget Mg²⁺ konsentrasi

—— Ngoptimalake Mg²⁺ konsentrasi kanggo saben template lan kombinasi primer

A-6 Kontaminasi karo DNA asing

—— Gunakake tips tahan aerosol lan enzim UDG.

P: Pita smear

A-1 Konten produk untai pertama banget

—— Ngurangi jumlah produk untai pisanan ing langkah reaksi PCR konvensional.

A-2 Jumlah primer sing gedhe banget ing reaksi PCR

——Kurangi input primer.

A-3 Kakehan siklus

—— Ngoptimalake kahanan reaksi PCR lan nyuda nomer siklus PCR.

A-4 Suhu anil sing sithik banget

—— Tambah suhu anil kanggo nyegah inisiasi lan ekstensi sing ora spesifik.

A-5 fragmen oligonukleotida non-spesifik sing digawe amarga degradasi DNase saka DNA —— Ekstrak RNA berkualitas tinggi kanggo nyegah kontaminasi DNA.

P: Kepiye milih primer kanggo RT-PCR?

RT-PCR yaiku mbalikke transkripsi RNA dadi cDNA, lan banjur nggunakake cDNA transkripsi balik minangka template kanggo reaksi PCR kanggo nggedhekake fragmen target. Pilih primer acak, primer Oligo dT lan gen khusus miturut kahanan tartamtu ing eksperimen kasebut. Kabeh primer ing ndhuwur bisa digunakake kanggo mRNA sel eukariotik cendhak tanpa struktur hairpin.

Random primer: Cocog kanggo RNA dawa kanthi struktur jepit rambut, uga kabeh jinis RNA kayata rRNA, mRNA, tRNA, lsp. Umume digunakake kanggo reaksi RT-PCR ing cithakan siji.

Oligo dT: Cocog kanggo RNA kanthi tailing PolyA (RNA prokariotik, eukariotik Oligo dT rRNA lan tRNA ora ana buntut PolyA). Amarga Oligo dT kaiket karo buntut PolyA, kualitas sampel RNA dibutuhake supaya dhuwur, lan sanajan degradasi sing sithik bakal nyuda sintesis cDNA kanthi dawa.

Primer khusus gen: Tambahan kanggo urutan template, cocog kanggo kahanan urutan target dingerteni.

P: Kepiye konfirmasi sukses transkripsi mbalikke RNA menyang untai pertama cDNA?

Ana rong cara:

1. Metode referensi internal: Miturut teori, cDNA minangka fragmen DNA kanthi dawa sing beda, mula asil elektroforesis yaiku smear. Yen kelimpahan RNA kurang, ora bakal ana produk sing nuduhake elektroforesis, nanging iki ora ateges ora ana produk sing bakal ditambah karo PCR. Umumé, referensi internal bisa digunakake kanggo ndeteksi cDNA. Yen referensi internal duwe asil, kualitas cDNA bisa dijamin ing dhasar (ing sawetara kasus, yen fragmen gen target dawa banget, bisa uga ana pangecualian).

2. Yen ana gen sing dingerteni dikuatake karo template iki, bisa diverifikasi dening primer gen iki. Penguatan referensi internal ora ateges ora ana masalah karo cDNA. Amarga referensi internal nduweni akeh katrampilan ing cDNA, mula gampang digedhekake. Yen cDNA sebagian didegradasi amarga macem-macem sebab, saka perspektif kemungkinan, asil PCR gen target kelimpahan kurang bakal kena pengaruh banget. Nalika referensi internal isih akeh, amplifikasi bisa uga ora bakal kena pengaruh.

P: RT-PCR bisa nggedhekake gen referensi internal nanging ora target gen

Ngundhakake parsial RNA. Ndeteksi integritas lan pemurnian RNA

Isi RNA saka macem-macem spesies bisa uga beda, nanging umume, total RNA sing diekstrak kudu ngemot rong pita 28S lan 18S sing jelas ing elektroforesis gel, lan padhange band sadurunge kudu kaping pindho luwih dhuwur tinimbang sing pungkasan. Pita 5S nuduhake manawa RNA wis mudhun, lan padhange sebanding karo derajat degradasi. Penguatan referensi internal sing sukses ora ateges ora ana masalah karo RNA, amarga referensi internal akeh banget, RNA bisa ditambah nalika degradasi ora parah. OD₂₆₀/ OD₂₈₀rasio RNA murni sing diukur kanthi spektrofotometer kudu antara 1,9 lan 2.1. Sawetara impurity protein ing RNA bakal nyuda rasio. Anggere regane ora sithik, RT ora bakal kena pengaruh. Sing paling penting kanggo RT yaiku integritas RNA.

P: Kepiye konfirmasi sukses RT?

Ekstensi gen referensi internal mung bisa nuduhake manawa RT wis sukses, nanging ora mesthi ana gandhengane karo kualitas untaian cDNA. Amarga fragmen referensi internal umume ukurane lan ekspresine dhuwur, mula luwih gampang dadi transkrip balik. Nanging, ukuran lan ekspresi gen target beda-beda gumantung saka gen menyang gen. Kualitas cDNA ora bisa diadili mung kanthi referensi internal, utamane fragmen target luwih saka 2 kb.

Sawetara conto duwe struktur sekunder sing kompleks, utawa nduweni konten GC sing akeh, utawa larang regane lan turah mbrawah. Ing kasus kasebut, transkripase mbalikke sing cocog kudu dipilih miturut ukuran fragmen target lan conto. Kanggo template RNA kanthi konten GC sing dhuwur lan struktur sekunder sing kompleks, angel mbukak struktur sekunder kanthi suhu sithik, utawa transkripase balik umum. Kanggo template kasebut, Quant Reverse Transcriptase bisa dipilih, amarga kinerja transkripsi balik jelas luwih apik tinimbang transkripase seri M-MLV, sing bisa mbalikke transkripsi macem-macem template RNA kanthi efisien lan transkripsine RNA dadi untaian pertama cDNA nganti maksimal. Nalika nggunakake kit transkripase balik umum, sistem 20 μl mung bisa mbalikke transkripsi kanthi efektif 1 μg saka total RNA. Coba waca kapasitas kit maksimum RT. Yen template ditambahake kanthi berlebihan, transkripsi mbalikke bakal luwih milih RNA kanthi akeh. Mula, luwih becik ora ngluwihi kapasitas maksimum sistem.

P: RT-PCR ora bisa nambah gen referensi internal

A-1 Temtokake manawa RNA diremehake banget lan yen RT sukses

Umumé, alesan kenapa gagal amplifikasi referensi internal asring disebabake amarga degradasi RNA sing serius. Alasan liya sing bisa ditindakake yaiku kegagalan transkripsi terbalik. Referensi internal ora bisa digunakake minangka standar kanggo ngadili kualitas untai tunggal cDNA, nanging bisa digunakake minangka standar kanggo menilai manawa transkripsi terbalik sukses yen ora ana masalah kualitas RNA. Sing paling penting ing proses transkripsi mbalikke yaiku njaga suhu sing tetep lan sistem reaksi konstan kanggo nambah efisiensi reaksi.

A-2 Temtokake manawa primer kanggo nambahake gen referensi internal bisa dipercaya lan yen ana masalah karo reagen sing digunakake ing PCR.

P: Nalika ndeteksi level RNA kanggo kuantifikasi relatif, apa prelu ngowahi transkrip dadi cDNA kanthi konsentrasi RNA kanggo saben sampel konsisten?

Kanggo kuantifikasi relatif, RNA kudu diitung sadurunge transkripsi mbalikke, sing uga dibutuhake ing akeh kit transkripsi mbalikke, kayata, ngitung input RNA dadi 1 μg. Amarga cDNA transkripsi balik minangka solusi campuran, kalebu RNA, oligo dT, enzim, dNTP, lan uga residu DNA sing sithik, mula bakal nyimpang, mula ora bisa ngetung cDNA kanthi akurat. Mula, perlu diitung kuantitas RNA. Ngelingi efisiensi transkripsi mbalikke padha karo macem-macem conto, jumlah cDNA sing dipikolehi kudu padha, lan analisis kuantitatif bisa nuduhake perbandingan level ekspresi gen sing beda kanthi jumlah RNA sing padha. Nalika nindakake PCR kuantitatif fluoresensi relatif, cDNA kuantitatif bisa uga ora dibutuhake sawise transkripsi terbalik amarga gen referensi internal bisa ditrapake minangka referensi.

P: Apa bisa ngowahi fragmen dawa transkrip?

Utamane ana gandhengane karo gen, lan transkripsi balik fragmen dawa ora bisa ditindakake kanggo umume gen. Kaping pisanan, efisiensi transkripsi balik luwih murah tinimbang PCR. Kapindho, wilayah sing sugih GC lan struktur sekunder akeh gen sing mbatesi transkripsi terbalik lan PCR. Pungkasane, efisiensi lan efisiensi PCR angel dijamin sekaligus. Ing proses transkripsi balik, ora ana sing bisa njamin entuk fragmen dawa kanggo gen salinan sing sithik, utamane nggunakake oligo dT. Dene 5 'UTR kanthi GC luwih akeh, luwih angel. Mula, isih kalebu cara sing cukup kanggo mbalikke transkrip kanthi primer acak, nemokake situs pamblokiran alami ing fragmen target, nambah kanthi segmen, lan banjur nindakake pencernaan lan ligasi watesan. Umumé, angel kanggo langsung nggedhekake fragmen luwih saka 2 kb, nanging ora mesthi ora bisa dipikolehi: 1. Kaping pisanan, njamin integritas RNA / mRNA, lan ekstraksi TRIZOL luwih disenengi. 2. Kit M-MLV RT-PCR bisa digunakake langsung. Tambah wektu anil lan tambah nomer siklus ing proses amplifikasi kanthi bener. Utawa, PCR sing bersarang bisa ditrapake, utawa nindakake siji utawa rong reaksi dhisik kanthi denaturasi dawa lan wektu ekstensi sadurunge amplifikasi PCR normal, sing bisa mbantu nambah fragmen. Pay manungsa waé kanggo kasetyan saka polimerase. 3. Long Taq bisa digunakake ing PCR kanggo entuk asil sing ideal. 4. Kanggo aplikasi ekspresi protein, polimerase kasetyan sing dhuwur kudu ditrapake.

P: Fitur produk Quant / King Reverse Transcriptase lan bedane saka TIANScript M-MLV.

Ana rong jinis transkripase mbalikke sing ditawakake TIANGEN: Quant / King RTase lan TIANScript M-MLV. Bedane utama yaiku input template. Quant minangka transkripase terbalik unik, sing beda karo M-MLV sing umume digunakake sing asale saka Moloney leukemia virus moline. Quant minangka transkripase terbalik efisiensi tinggi anyar kanthi rekayasa sing ditulis dening teknik Escherichia coli. Quant cocog kanggo nambah 50 ng-2 μg RNA kanthi kegiatan transkriptif terbalik sing dhuwur lan panen sing dhuwur. Dibandhingake karo MMLV utawa AMV biasa, karakteristik Quant sing paling gedhe yaiku afinitas sing kuat karo template RNA lan bisa ngowahi template kompleks transkrip tanpa denaturasi suhu tinggi. Kanggo template kanthi konten GC sing luwih dhuwur, efisiensi terbalik luwih dhuwur. Nanging, transkripase mbalikke iki duwe kegiatan RNase H, sing bisa mengaruhi dawa produk cDNA (cocog kanggo template <4,5 kb). Kanggo transkripsi balik konvensional, disaranake transkripase TIANScript MMLV. RTase iki minangka enzim modifikasi kanthi aktivitas RNase H sing ringkih banget, sing cocog kanggo sintesis cDNA dawa (> 5 kb).

P: Kepiye milih antarane RT-PCR siji langkah lan rong langkah?

Transkripsi mbalikke siji langkah lan amplifikasi PCR rampung ing tabung sing padha tanpa mbukak tutup tabung ing antarane sintesis lan amplifikasi cDNA, sing migunani kanggo nyuda kontaminasi. Amarga kabeh conto cDNA sing dipikolehi digunakake kanggo amplifikasi, sensitivitas luwih dhuwur, kanthi minimal 0,01 pg total RNA. Kanggo RTPCR siji langkah sing sukses, primer khusus gen umume digunakake kanggo miwiti sintesis cDNA. Cara rong langkah, yaiku transkripsi balik lan amplifikasi PCR ditindakake kanthi rong langkah. Kaping pisanan transkripsi balik digawe saka template RNA kanggo entuk cDNA, lan cDNA sing dipikolehi ngalami reaksi PCR utawa liyane. Cara rong langkah bisa nggunakake oligo (dT) utawa primer acak kanggo nuntun sintesis untaian pertama cDNA, lan bisa mbalikke transkripsi kabeh informasi mRNA saka conto tartamtu.

Tulis pesen sampeyan ing kene lan kirimake menyang kita