Kit PCR (MSP) spekulasi metilasi

Cithakan A-1

■ Cithakan kasebut ngemot impurities protein utawa inhibitor Taq, lsp. --—Cithakan DNA murni, mbusak kotoran protein utawa ekstrak DNA template kanthi kit pemurnian.

■ denaturasi template ora lengkap ——Menakake nambah suhu denaturasi lan nambah wektu denaturasi.

■ Cithakan degradasi ——Siapake maneh cithakan.

A-2 Utami

■ Kualitas sepisanan sing kurang apik ——Rancang maneh sintesis primer.

■ Kerusakan primer ——Klik primer konsentrasi dhuwur dadi volume cilik kanggo dijaga. Supaya ora ana beku lan cair utawa jangka panjang 4 ° C.

■ Desain primer sing ora bener (kayata dawa primer ora cukup, dimer sing dibentuk ing antarane primer, lsp) -Resign primer (aja nganti pembentukan primer dimer lan struktur sekunder)

A-3 Mg²⁺konsentrasi

■ Mg²⁺ konsentrasi kurang banget ——Benerake nambah Mg²⁺ konsentrasi: Ngoptimalake Mg²⁺ konsentrasi dening serangkaian reaksi saka 1 mM nganti 3 mM kanthi interval 0,5 mM kanggo nemtokake Mg optimal²⁺ konsentrasi kanggo saben template lan sepisanan.

A-4 Suhu penyemprot

■ Suhu anil sing akeh mengaruhi ikatan primer lan template. —— Ngurangi suhu anil lan ngoptimalake kondhisi kanthi gradien 2 ° C.

A-5 Wektu ekstensi

■ Wektu extension cekak —— Tambah wektu extension.

Fenomena: Sampel negatif uga nuduhake band urutan target.

Kontaminasi A-1 saka PCR

■ Kontaminasi salib saka urutan target utawa produk amplifikasi —— Ati-ati aja pipet conto sing ngemot urutan target ing sampel negatif utawa tumpahake metu saka tabung empar. Reagen utawa peralatan kudu dikonfigurasi kanthi otomatis kanggo ngilangi asam nukleat sing ana, lan anané kontaminasi kudu ditemtokake liwat eksperimen kontrol negatif.

■ Kontaminasi Reagen --— Ngatur reagen lan simpen ing suhu sithik.

A-2 Perdanar

■ Mg²⁺ konsentrasi kurang banget ——Benerake nambah Mg²⁺ konsentrasi: Ngoptimalake Mg²⁺ konsentrasi dening serangkaian reaksi saka 1 mM nganti 3 mM kanthi interval 0,5 mM kanggo nemtokake Mg optimal²⁺ konsentrasi kanggo saben template lan sepisanan.

■ Desain primer sing ora bener, lan urutan target duwe homologi kanthi urutan non-target. ——Desain desain ulang.

Fenomena: Pita amplifikasi PCR ora salaras karo ukuran sing diarepake, gedhe utawa cilik, utawa kadang band amplifikasi spesifik lan band amplifikasi non-spesifik.

A-1 Primer

■ Kekhususan primer sing kurang apik

——Desain desain ulang.

■ Konsentrasi primer dhuwur banget ——Benerake nambah suhu denaturasi lan nambah wektu denaturasi.

A-2 Mg²⁺ konsentrasi

■ Ibu²⁺ konsentrasi dhuwur banget —— Ngurangi konsentrasi Mg2 + kanthi bener: Ngoptimalake Mg²⁺ konsentrasi dening serangkaian reaksi saka 1 mM nganti 3 mM kanthi interval 0,5 mM kanggo nemtokake Mg optimal²⁺ konsentrasi kanggo saben template lan sepisanan.

A-3 Polimerase paling apik

■ Jumlah enzim sing akeh banget —— Ngurangi jumlah enzim sing cocog kanthi interval 0,5 U

A-4 Suhu penyemprot

■ Suhu anil terlalu sithik —— Cocogake nambah suhu anilasi utawa nganggo metode anil rong tahap

Siklus PCR A-5

■ Siklus PCR banget —— Kurangi jumlah siklus PCR.

A-1 Primer——Khususan khusus —Rancang maneh primer, ganti posisi lan dawa sepisanan kanggo nambah kekhususan; utawa nindakake PCR susuh.

DNA Cithakan A-2

——Cithakan iku ora murni —— Purifikasi template utawa ekstrak DNA nganggo kit pemurnian.

A-3 Mg²⁺ konsentrasi

——Mg²⁺ konsentrasi dhuwur banget --— Nyuda nyuda Mg²⁺ konsentrasi: Ngoptimalake Mg²⁺ konsentrasi dening serangkaian reaksi saka 1 mM nganti 3 mM kanthi interval 0,5 mM kanggo nemtokake Mg optimal²⁺ konsentrasi kanggo saben template lan sepisanan.

A-4 dNTP

—— Konsentrasi dNTP dhuwur banget —— Ngurangi konsentrasi dNTP kanthi tepat

A-5 Suhu penyemprot

——Suhu anil sing sithik banget ——Menakake suhu annealing sing cocog

Siklus A-6

—— Akeh siklus --— Ngoptimalake nomer siklus

Langkah pertama yaiku milih polimerase sing cocog. Polimerase Taq reguler ora bisa diowahi amarga ora ana kegiatan eksonuc please 3'-5, lan ora cocog bakal nyuda efisiensi ekstensi fragmen. Mula, polimerase Taq biasa ora bisa nambah fragmen target kanthi luwih gedhe tinimbang 5 kb. Taq polimerase kanthi modifikasi khusus utawa polimerase kesetiaan sing dhuwur kudu dipilih kanggo nambah efisiensi ekstensi lan nyukupi kebutuhan amplifikasi fragmen dawa. Kajaba iku, amplifikasi fragmen dawa uga mbutuhake penyesuaian desain primer, wektu denaturasi, wektu ekstensi, pH buffer, lsp. Biasane, primer kanthi 18-24 bp bisa nyebabake panen sing luwih apik. Kanggo nyegah kerusakan template, wektu denaturasi ing 94 ° C kudu dikurangi dadi 30 detik utawa kurang saben siklus, lan wektu paningkatan suhu nganti 94 ° C sadurunge amplifikasi kurang saka 1 menit. Kajaba iku, nyetel suhu ekstensi udakara 68 ° C lan ngrancang wektu ekstensi miturut tarif 1 kb / menit bisa njamin amplifikasi efektif fragmen dawa.

Tingkat kesalahan amplifikasi PCR bisa dikurangi kanthi nggunakake macem-macem polimerase DNA kanthi kasetyan sing dhuwur. Antarane polimerase DNA Taq sing ditemokake nganti saiki, enzim Pfu nduweni tingkat kesalahan paling murah lan kasetyan paling dhuwur (deleng tabel sing dipasang). Saliyane pilihan enzim, peneliti luwih bisa nyuda tingkat mutasi PCR kanthi ngoptimalake kahanan reaksi, kalebu ngoptimalake komposisi buffer, konsentrasi polimerase termostable lan ngoptimalake nomer siklus PCR.